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外泌體（Exosomes）是一類直徑約30-150 nm的細胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs），可由多種類型細胞在正常及病理狀態(tài)下分泌，廣泛參與細胞間通訊，并在腫瘤微環(huán)境調(diào)控、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)退行性疾病等多個研究領(lǐng)域展現(xiàn)出重要價值[1]。隨著外泌體研究的深入，如何高效可靠地分離外泌體成為科研人員關(guān)注的焦點。不同的分離方法在純度、回收率、操作便捷性等方面各有千秋，研究者需根據(jù)自己的實驗需求選擇最合適的分離方法。
本期細胞學(xué)堂將全面介紹外泌體分離的五個主要方法，并深入探討如何選擇合適的方法分離外泌體，助您順利展開實驗。
如何選擇合適的外泌體分離方法
外泌體分離主要方法詳解
超速離心法
（Ultracentrifugation, UC）
原理
超速離心法是根據(jù)樣品中外泌體與其他成分在尺寸和密度上的差異，通過一系列不同離心力和離心時間的超速離心步驟，逐步去除非外泌體成分，最終將外泌體沉淀并重新懸浮。
圖1 超速離心流程示意圖[2]
優(yōu)點
1
去除了大部分污染物，分離得到的外泌體較純凈
2
適用于大體積樣本（如細胞培養(yǎng)上清、血清等）
3
無需額外試劑，避免了化學(xué)試劑的污染
缺點
1
需要超速離心機，設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜
2
高離心力可能導(dǎo)致外泌體結(jié)構(gòu)損傷，影響其完整性
3
回收率較低，部分外泌體可能無法有效沉淀
密度梯度離心法
（Density Gradient Centrifugation, DGC）
原理
密度梯度離心法是一種基于外泌體與其他細胞成分密度差異的精細分離技術(shù)。通常使用蔗糖或碘克沙醇（Iodixanol）作為密度梯度介質(zhì)，并通過超速離心來實現(xiàn)。外泌體會根據(jù)自身浮力密度（1.13–1.19 g/mL）在特定界面富集。
分離步驟
1
樣品預(yù)處理：離心去除細胞碎片和大顆粒雜質(zhì)；
2
密度梯度制備：通過逐漸混合不同密度的蔗糖或碘克沙醇溶液，形成一個從低密度到高密度的連續(xù)密度梯度；
3
樣品加載與超速離心：將外泌體粗提物（PBS重懸后）緩慢鋪于密度梯度頂部，以100,000–120,000 ×g，16-18 h，4℃進行超速離心；
4
外泌體收集：使用移液器或取樣管在1.13-1.19 g/mL密度范圍內(nèi)回收富集的外泌體層；
5
介質(zhì)去除與重懸：將收集到的外泌體用PBS稀釋后再次進行100,000 ×g，70 min離心，去除梯度介質(zhì)并重懸外泌體。
優(yōu)點
1
外泌體純度高，可去除蛋白、脂質(zhì)等污染物
2
適用于對外泌體功能研究要求較高的實驗
缺點
1
操作繁瑣，需要長時間（≥16 h）離心
2
樣本處理量小，不適合大規(guī)模樣本分離
尺寸排阻色譜法
（Size-Exclusion Chromatography, SEC）
原理
利用多孔球狀填料形成色譜柱，樣本流經(jīng)色譜柱時，不同尺寸的分子以不同速率流出。外泌體（30-150 nm）介于大蛋白與細胞外囊泡之間，可在特定洗脫體積內(nèi)被收集。
分離步驟
1
樣品預(yù)處理：去除大顆粒雜質(zhì)，并適當(dāng)濃縮樣品以提高分離效率；
2
色譜柱準(zhǔn)備：裝填適合外泌體分離的填料，使用緩沖液平衡柱體；
3
樣品上樣：緩慢加載樣品，避免擾動填料結(jié)構(gòu)；
4
洗脫與收集：按分級洗脫原則，優(yōu)先收集外泌體富集部分；
5
濃縮與純化（可選）：使用超濾或二次離心等方法提高外泌體純度。
優(yōu)點
1
溫和無損傷，外泌體結(jié)構(gòu)保持完整
2
操作簡便，無需超速離心設(shè)備
3
分離效果較好，可去除蛋白污染
缺點
1
純度受限，仍可能殘留其他細胞外囊泡
2
不適用于超大體積樣本
聚合物沉淀法
（Polymer Precipitation）
原理
利用聚合物（如聚乙二醇，PEG）降低外泌體表面水合層的溶解度，使其在低速離心條件下沉淀，從而從生物樣本中分離外泌體
分離步驟
1
樣品預(yù)處理：去除大顆粒雜質(zhì)，提高外泌體回收率；
2
添加聚合物溶液：充分混勻，低溫孵育使外泌體沉淀；
3
離心收集：低速離心獲取沉淀，去除上清；
4
重懸與純化（可選）：使用緩沖液重懸，可結(jié)合其他純化方法，如超濾、密度梯度離心等以提高純度。
優(yōu)點
1
操作簡單，時間短（< 4 h）
2
無需昂貴設(shè)備，適用于實驗室常規(guī)分離
3
適合大體積樣本（血清、尿液等）
缺點
1
可能存在聚合物殘留污染，影響下游實驗（如蛋白分析）
2
共沉淀大量蛋白和其他顆粒，外泌體純度較低
免疫親和分離法
（Immunoaffinity-Based Isolation）
原理
利用磁珠或親和樹脂為固相載體，表面固定CD9、CD63、CD81等外泌體特異性抗體，特異性結(jié)合并分離外泌體。
分離步驟
1
樣品預(yù)處理：去除大顆粒雜質(zhì)，提高分離效率；
2
抗體結(jié)合：靶向外泌體表面標(biāo)志物的抗體與固相載體偶聯(lián)；
3
外泌體捕獲：將樣品與偶聯(lián)抗體孵育，使外泌體特異性結(jié)合；
4
洗滌與洗脫：去除非特異性結(jié)合物，釋放外泌體。
優(yōu)點
1
純度極-高，可用于特定類型外泌體富集
2
適用于高靈敏度分析（如qPCR、Western blot等）
缺點
1
試劑昂貴，適合小規(guī)模研究
2
易丟失部分外泌體，回收率低
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參考文獻
[1]
Théry C, Zitvogel L, Amigorena S. Exosomes: composition, biogenesis and function [J]. Nature Reviews Immunology, 2002 Aug; 2(8):569-579.
[2]
Théry C, Amigorena S, Raposo G, et al. Isolation andcharacterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids [J]. Current Protocols in Cell Biolog, 2006 Apr; Chapter 3: Unit 3.22.
[3]
Contreras-Naranjo JC, Wu HJ, Ugaz VM. Microfluidics for exosome isolation and analysis: enabling liquid biopsy for personalized medicine [J]. Lab on a Chip, 2017 Oct 25; 17(21):3558-3577.
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