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在4月17日普諾賽直播間中，徐老師從誘導(dǎo)分化步驟、細(xì)胞狀態(tài)及密度、試劑配置及保存、誘導(dǎo)結(jié)果展示4個(gè)方面為大家詳細(xì)介紹了間充質(zhì)干細(xì)胞成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化。直播回放請(qǐng)點(diǎn)擊微信公眾號(hào)菜單欄【資料中心】-【往期直播回放】查看，或在B站搜索“普諾賽生物"，點(diǎn)擊最新視頻觀看學(xué)習(xí)。
本期直播答疑，我們從直播間幾十個(gè)提問(wèn)中，篩選出部分代表性問(wèn)題，并做了詳細(xì)解答。若有其他問(wèn)題，歡迎大家在推文底部留言，或點(diǎn)擊微信公眾號(hào)菜單欄【快速查詢】-【在線咨詢】，我們將在線解答。
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成脂誘導(dǎo)前不需要接觸抑制2天嗎？有的文獻(xiàn)說(shuō)必須要接觸抑制細(xì)胞才能分化。
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可根據(jù)當(dāng)前的細(xì)胞狀態(tài)以及使用的誘導(dǎo)試劑來(lái)決定是否接觸抑制；
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使用普諾賽的成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞時(shí)，不需要接觸抑制2天。在細(xì)胞接種后，密度達(dá)到95%-100%時(shí)，即可開(kāi)始誘導(dǎo)；
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誘導(dǎo)期間細(xì)胞是在緩慢增殖和誘導(dǎo)分化的。在這個(gè)過(guò)程中，細(xì)胞會(huì)逐漸退出生長(zhǎng)期，同時(shí)也保證了細(xì)胞處于最佳狀態(tài)開(kāi)始分化。
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2.油紅O染色液過(guò)濾用什么濾紙？
使用0.22 μm或0.45 μm的尼龍材質(zhì)濾膜或中性濾紙進(jìn)行過(guò)濾，去除油紅O染色液中的雜質(zhì)。
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AB液培養(yǎng)交替時(shí)，需要用PBS充分洗滌嗎？推薦的洗滌次數(shù)是？
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在成脂誘導(dǎo)過(guò)程中，A液和B液交替換液；
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換液時(shí)，可以用PBS洗滌細(xì)胞1次，但需要注意操作時(shí)清洗細(xì)胞的次數(shù)越多，越容易造成細(xì)胞卷邊漂??；
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若操作熟練且細(xì)胞狀態(tài)較好，可以盡可能的吸去A液，然后再沿著孔壁緩慢加入預(yù)熱好的新鮮B液，反之亦然；若操作不熟練，可嚴(yán)格按照以下操作：用PBS 清洗細(xì)胞1次，換液時(shí)可先吸出大部分培養(yǎng)基或PBS緩沖液丟棄，留少量原液在孔板內(nèi)作為緩沖，接著沿孔壁緩慢加入要更換的預(yù)熱新鮮培養(yǎng)基。
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3T3細(xì)胞可以用于成脂誘導(dǎo)嗎？誘導(dǎo)流程是和間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)的一樣嗎？MC3T3-E1細(xì)胞也是按照間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)步驟進(jìn)行誘導(dǎo)嗎？
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3T3-L1(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)細(xì)胞可進(jìn)行成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，普諾賽也有配套的成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（貨號(hào)：PD-031），具體步驟可以參考配套誘導(dǎo)分化試劑的說(shuō)明書(shū)；
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MC3T3-E1 Subclone 14 (小鼠顱頂前骨細(xì)胞亞克隆14)細(xì)胞可用于成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，普諾賽也有配套的成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（貨號(hào)：PD-033），具體步驟可以參考配套誘導(dǎo)分化試劑的說(shuō)明書(shū)。
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在誘導(dǎo)過(guò)程中拍照要打開(kāi)蓋子嗎？如何通過(guò)觀察細(xì)胞，后續(xù)進(jìn)行誘導(dǎo)條件調(diào)整？
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如果是在誘導(dǎo)過(guò)程中拍照觀察細(xì)胞狀態(tài)，請(qǐng)不要打開(kāi)蓋子，防止細(xì)胞污染，影響后續(xù)細(xì)胞的狀態(tài)；
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誘導(dǎo)過(guò)程中可通過(guò)鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，比如細(xì)胞是否出現(xiàn)卷邊漂浮、碎裂、污染等情況來(lái)判斷誘導(dǎo)過(guò)程是否順利；
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若誘導(dǎo)過(guò)程中，細(xì)胞出現(xiàn)輕微卷邊現(xiàn)象，在換液過(guò)程中要更加輕柔，可留少量原液作為緩沖，培養(yǎng)基37℃復(fù)溫后再使用；或者使用包被過(guò)的孔板進(jìn)行誘導(dǎo)，增強(qiáng)細(xì)胞的吸附性，減少卷邊漂浮的情況；
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若發(fā)現(xiàn)污染情況，請(qǐng)立即排查試劑、耗材等污染源，小心處理已經(jīng)污染的板子，防止污染其他孔板；
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實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，建議多做幾個(gè)單獨(dú)孔板的重復(fù)組。在誘導(dǎo)后期，可通過(guò)鏡下觀察和染色來(lái)判斷誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)是否成功。
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舊包裝誘導(dǎo)劑的哪些成分需要-20℃保存？也是不能反復(fù)凍融的嗎？
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舊包裝的誘導(dǎo)試劑保存條件可參照說(shuō)明書(shū)和試劑管上標(biāo)簽備注的保存條件進(jìn)行保存；
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舊包裝的成骨誘導(dǎo)試劑中：FBS、谷氨酰胺、青鏈霉素、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸和地塞米松B均需要-20℃保存；不建議反復(fù)凍融，若一次用不完可分裝后凍存；
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舊包裝的成脂誘導(dǎo)試劑中：FBS、谷氨酰胺、青鏈霉素、胰島素、IBMX、羅格列酮和地塞米松A均需要-20℃保存；不建議反復(fù)凍融，若一次用不完可分裝后凍存；
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舊包裝的成軟骨誘導(dǎo)試劑中：丙酮酸鈉、ITS添加物、TGF-β3、抗壞血酸、脯氨酸、地塞米松B和青鏈霉素均需要-20℃保存；不建議反復(fù)凍融，若一次用不完可分裝后凍存。
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成骨的各種試劑也需要預(yù)熱嗎？
成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基配置完成后，使用前需37℃復(fù)溫半小時(shí)以上，手感溫?zé)峒纯墒褂?/span>。預(yù)熱的主要目的是為了避免過(guò)大溫差對(duì)細(xì)胞造成刺激，導(dǎo)致細(xì)胞收縮、卷邊甚至脫壁，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
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成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基自己配制好配嗎？
如果購(gòu)買(mǎi)的是普諾賽配套的成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，可按照說(shuō)明書(shū)的配比添加相應(yīng)成分配置即可，配置簡(jiǎn)單。如果是參考文獻(xiàn)中的配方自己配置誘導(dǎo)試劑，這個(gè)誘導(dǎo)效果就不好評(píng)估了，建議配置后先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下誘導(dǎo)效果。
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為什么要包被呢？細(xì)胞誘導(dǎo)久了容易聚集怎么解決呢？
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包被是為了增強(qiáng)器皿的吸附性，從而使細(xì)胞能夠更好地展開(kāi)，貼壁更牢，有效預(yù)防在誘導(dǎo)過(guò)程中細(xì)胞出現(xiàn)卷邊或漂浮的情況；
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若細(xì)胞誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)了，出現(xiàn)聚集的情況，老師在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)可注意提前包被孔板、控制初始細(xì)胞接入量、細(xì)胞鋪板均勻、換液輕柔、培養(yǎng)基復(fù)溫等細(xì)節(jié)，盡量減少對(duì)細(xì)胞的刺激。
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拍照有什么注意事項(xiàng)嗎？
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在誘導(dǎo)過(guò)程中拍照時(shí)，請(qǐng)確保調(diào)整好焦距，并選擇合適的位置來(lái)拍攝不同倍鏡下的細(xì)胞圖片；
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染色后拍照時(shí)，請(qǐng)注意不同顯微鏡可能拍出略有差異的顏色。因此，需要仔細(xì)觀察鏡下顏色，確定拍出的染色圖沒(méi)問(wèn)題。同時(shí)清洗完染液后，可留適量的PBS，以減少光圈的出現(xiàn)，從而呈現(xiàn)出更好的效果圖。
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成軟骨誘導(dǎo)完成后，進(jìn)行包埋切片，切片是切多少微米的呢?我的球每次培養(yǎng)都很小，直徑都沒(méi)有1mm不知道是不是正常的，切片也只能切兩三片，掃描也看不清楚，是為什么呢？
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軟骨球切片厚度為3~5 μm，誘導(dǎo)結(jié)束后的軟骨球直徑大概在1~2 mm左右；
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開(kāi)始誘導(dǎo)的細(xì)胞量需要嚴(yán)格控制在2.5~3*105 cells/0.5 mL/管；
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細(xì)胞量太多的話，球過(guò)大，誘導(dǎo)過(guò)程中可能會(huì)導(dǎo)致一些細(xì)胞死亡，球破裂；細(xì)胞量太少的話可能難以形成球，即便形成了較小的軟骨球，后續(xù)操作也不好進(jìn)行；
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培養(yǎng)的球直徑比較小，可能原因是初始細(xì)胞量較少、誘導(dǎo)時(shí)間短、沒(méi)有誘導(dǎo)成功等。切片厚度可以控制在4 μm，切片正常的話，肉眼可觀察到有一個(gè)很小的軟骨球片，呈小圓餅狀，染色后肉眼可見(jiàn)更加明顯。
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這三個(gè)誘導(dǎo)，原代細(xì)胞都要用3代以內(nèi)細(xì)胞么？
原代細(xì)胞是組織現(xiàn)提取分離的，體外培養(yǎng)代次有限，且隨著細(xì)胞代次的增加，細(xì)胞的增殖速度以及狀態(tài)也會(huì)慢慢變差。建議使用三代以內(nèi)的細(xì)胞開(kāi)始誘導(dǎo)，在細(xì)胞狀態(tài)最佳的時(shí)候進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，做出來(lái)的結(jié)果也會(huì)相對(duì)更好。
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人細(xì)胞的成軟骨分化試劑盒可以用于小鼠的細(xì)胞嗎？
建議使用對(duì)應(yīng)種屬的成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，效果最-佳。但也有相關(guān)資料顯示，成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基對(duì)種屬的要求沒(méi)有那么嚴(yán)格，一般人的成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基也可以用于小鼠。然而誘導(dǎo)過(guò)程中的影響因素較多，如果混用的話，建議先做預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行摸索。
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成軟骨的鑒定，除了染色，有沒(méi)有什么特異的靶標(biāo)？
軟骨結(jié)構(gòu)復(fù)雜，主要是由一些基質(zhì)成分組成，包括II 型、IX 型、X I型膠原和一些蛋白多聚糖，其中以II型膠原（Collagen II）和糖胺聚糖為主。成軟骨誘導(dǎo)過(guò)程中會(huì)生成蛋白多聚糖和Collagen II等細(xì)胞外基質(zhì)，可通過(guò)免疫熒光染色、甲苯胺藍(lán)/阿利辛藍(lán)染色、qRT-PCR 檢測(cè)成軟骨特異指標(biāo)Ⅱ型膠原、蛋白多糖和成軟骨轉(zhuǎn)錄因子 SOX9 的基因表達(dá)及蛋白合成情況，具體可參考文獻(xiàn)。
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