Q1

傳代時(shí)，細(xì)胞密度比較低，但是培養(yǎng)基又

變黃了，怎么辦？

細(xì)胞培養(yǎng)過程中，如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞量較少，但培養(yǎng)基變黃較快，可以從以下3個(gè)方面進(jìn)行排查：

? 檢查培養(yǎng)基成分是否正常，如NaHCO₃濃度是否偏低；

? 檢查培養(yǎng)箱內(nèi)CO₂濃度是否過高，一般培養(yǎng)基添加濃度為1.5g/L或2.2g/L的NaHCO_3，使用5% CO₂進(jìn)行平衡；添加濃度為3.7g/L的NaHCO₃可使用10% CO₂進(jìn)行平衡；

? 是否存在某種污染物，與細(xì)胞競爭營養(yǎng)，導(dǎo)致培養(yǎng)基快速消耗。一般先排除細(xì)菌和真菌污染，通過培養(yǎng)法檢查即可（不加抗生素培養(yǎng)檢查），如排除細(xì)菌和真菌污染，可進(jìn)行支原體檢測，確定是否存在支原體污染。

Q2

半換液算傳代嗎？怎么計(jì)算代數(shù)？

對(duì)于有限傳代的細(xì)胞，細(xì)胞的代次可以用以下公式進(jìn)行計(jì)算：

其中X為傳代前代次 ; I 為細(xì)胞接種前細(xì)胞數(shù)；Y 為培養(yǎng)后細(xì)胞總數(shù)

對(duì)于腫瘤細(xì)胞或無限傳代的細(xì)胞，傳代數(shù)僅僅代表操作的次數(shù)，與傳代比例和細(xì)胞增殖數(shù)量沒有直接關(guān)系；

半量換液的細(xì)胞，如果沒有進(jìn)行分瓶培養(yǎng)，建議按照常規(guī)的換液來計(jì)算，不計(jì)入傳代次數(shù)，如加入新鮮培養(yǎng)基后分瓶培養(yǎng)，則可以將傳代數(shù)+1。

Q3

本來成團(tuán)生長的細(xì)胞，不成團(tuán)了怎么辦？

細(xì)胞是否成團(tuán)生長，一般是跟細(xì)胞本身特性以及培養(yǎng)環(huán)境有關(guān)的。

如果是本來成團(tuán)生長的細(xì)胞，分散不成團(tuán)，且增殖速度變慢，可能是細(xì)胞狀態(tài)變差的癥狀。一般可以從是否污染（特別注意支原體檢查）、細(xì)胞培養(yǎng)基或血清是否變更以及操作過程是否對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷這三個(gè)方面進(jìn)行排查。

如果細(xì)胞僅僅是變成分散狀態(tài)，但是生長指標(biāo)都正常，則可能是由于培養(yǎng)條件或環(huán)境改變導(dǎo)致的，只要細(xì)胞生長正常且沒有其他異常癥狀，不需要過度關(guān)注。

Q4

懸浮細(xì)胞復(fù)蘇4-5天進(jìn)行凍存會(huì)影響

細(xì)胞活率嗎？

細(xì)胞是否適合凍存取決于細(xì)胞的生長狀態(tài)，用于凍存的細(xì)胞一般要求狀態(tài)良好，并處于快速增殖階段。

對(duì)于生長速度較快的懸浮細(xì)胞，4-5天可以傳代1-2次，狀態(tài)基本恢復(fù)，保證細(xì)胞處于生長旺盛的對(duì)數(shù)生長期即可凍存；

但是對(duì)于生長速度慢的細(xì)胞，4-5天細(xì)胞可能還處于狀態(tài)恢復(fù)中，沒有大量增殖，此時(shí)凍存可能會(huì)影響后續(xù)復(fù)蘇的狀態(tài)。建議復(fù)蘇后的細(xì)胞，培養(yǎng)1-2代，細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行凍存。

Q5

培養(yǎng)THP-1細(xì)胞兩周，培養(yǎng)液很容易變

黃，聚團(tuán)很嚴(yán)重，中間有黑渣渣，怎么辦？

如果細(xì)胞量沒有明顯增加，培養(yǎng)基很容易變黃，黑點(diǎn)多且細(xì)胞聚團(tuán)嚴(yán)重，懷疑細(xì)胞是存在某種污染，需要排除污染源后重新培養(yǎng)。

Q6

THP-1有少量貼壁細(xì)胞怎么處理？

如果出現(xiàn)少量貼壁，每次傳代培養(yǎng)時(shí)，只收集懸浮部分即可；如果需要完-全不貼壁，可以選擇低吸附的培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)。

Q7

培養(yǎng)幾天后，懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)基是不是

會(huì)變渾濁些？

懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞不一樣，培養(yǎng)上清是略顯渾濁的，隨著細(xì)胞量的增加渾濁度也會(huì)增加。

可以通過鏡檢結(jié)果來與細(xì)菌等污染物進(jìn)行區(qū)分，鏡檢細(xì)胞懸液，細(xì)胞間隙應(yīng)該是干凈的，但污染的細(xì)胞間隙一般是大量黑色顆粒，有些可以觀察到明顯的運(yùn)動(dòng)。

Q8

THP -1細(xì)胞量挺多，但培養(yǎng)基長時(shí)間不

變黃，有什么辦法？

培養(yǎng)基是否變黃只是細(xì)胞傳代的參考指標(biāo)。培養(yǎng)基變黃主要是細(xì)胞代謝產(chǎn)物積累導(dǎo)致，同時(shí)也會(huì)受到培養(yǎng)基的緩沖體系以及培養(yǎng)箱CO₂濃度的影響。如果細(xì)胞生長正常，并且到了傳代的量，則可以正常傳代。

對(duì)于THP-1細(xì)胞來說，如果細(xì)胞數(shù)量足夠但是培養(yǎng)基不變黃，可能是由于細(xì)胞接種時(shí)培養(yǎng)基pH值偏高（可能是培養(yǎng)基開啟時(shí)間過長，CO₂溢出導(dǎo)致的pH值升高），細(xì)胞數(shù)量雖多但沒有明顯代謝和增殖，所以顏色不容易變黃。所以建議不要直接分瓶，可以換用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)觀察。

Q9

Sf9細(xì)胞靜置培養(yǎng)時(shí)正常，轉(zhuǎn)入搖瓶懸浮

培養(yǎng)，停滯不長，但也沒死，是培養(yǎng)基不

適合懸浮培養(yǎng)嗎？

細(xì)胞培養(yǎng)條件的變更，如更換培養(yǎng)基，或者由靜置培養(yǎng)轉(zhuǎn)為搖瓶培養(yǎng)，都需要一個(gè)馴化和適應(yīng)的過程。

馴化過程，簡單說就是緩慢更換培養(yǎng)條件，如將新舊培養(yǎng)基按比例混合，讓細(xì)胞逐步適應(yīng)，或者在搖瓶培養(yǎng)前期，調(diào)低搖床轉(zhuǎn)速，讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)。將細(xì)胞直接轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基或培養(yǎng)環(huán)境可能導(dǎo)致細(xì)胞不長甚至死亡的情況。