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核酸適體是一段能特異性識(shí)別靶標(biāo)分子的單鏈DNA或RNA，已被廣泛用于各種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。然而，由于適體的構(gòu)象動(dòng)態(tài)易變，抗環(huán)境干擾能力弱，從而影響與靶標(biāo)的結(jié)合親和力以及核酸適體-靶標(biāo)復(fù)合物的穩(wěn)定性，因此與商業(yè)抗體相比，核酸適體在檢測(cè)和治療方面的性能通常一般。
湖南大學(xué)化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的王丹博士為我們闡述了如何合理地設(shè)計(jì)親電標(biāo)簽功能化的核酸適體通過點(diǎn)擊化學(xué)的共價(jià)偶聯(lián)技術(shù)實(shí)現(xiàn)新-冠病毒的靈敏檢測(cè)和侵染阻斷，進(jìn)一步推動(dòng)了適體在診斷、分子成像、疾病治療和其他生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。該研究于2023年1月2日發(fā)表于國(guó)際知-名雜志ACS Central Science (IF=18.2)，題為Robust Covalent Aptamer Strategy Enables Sensitive Detection and Enhanced Inhibition of SARS-CoV-2 Proteins。
圖1 該研究發(fā)表于國(guó)際期刊ACS Central Science
01
研究背景
為了提高結(jié)合適體親和力并減少其與靶標(biāo)復(fù)合物的解離，人們開發(fā)了二價(jià)或多價(jià)適體的分子組裝策略，以及將疏水基團(tuán)整合到適體中以增加結(jié)合能力的分子工程策略。然而，這些策略沒有改變適體和靶標(biāo)之間的非共價(jià)結(jié)合模式，對(duì)核酸適體的結(jié)合親和力以及核酸適體-靶標(biāo)復(fù)合物穩(wěn)定性的提升有限。目前共價(jià)核酸適體的概念和應(yīng)用還處于起步階段，并沒有被廣泛開發(fā)和認(rèn)識(shí)。因此，促進(jìn)共價(jià)核酸適體概念的開發(fā)和擴(kuò)大共價(jià)核酸適體的應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⑹欠浅Ｖ匾摹?/p>
02
工作設(shè)計(jì)
為解決上述問題，作者將三種親電性官能團(tuán)與核酸適體偶聯(lián)以開發(fā)共價(jià)核酸適體，作為SARS-CoV-2 蛋白的檢測(cè)探針和功能性阻斷中和劑(圖2)。三種共價(jià)核酸適體分別為硫酰氟修飾的適體(SF-Apt)，N-羥基琥珀酰亞胺修飾的適體(NHS-Apt)以及丙烯酰胺修飾的適體(Acr-Apt)。作為概念驗(yàn)證，作者選擇SARS-CoV-2的核衣殼蛋白 (NP) 和刺突蛋白受體結(jié)合域 (RBD)作為研究對(duì)象探究共價(jià)核酸適體性能。NP 是 SARS-CoV-2 最保守和最-豐富的結(jié)構(gòu)蛋白，是早期檢測(cè)和可靠診斷的最-佳選擇。RBD是SARS-CoV-2識(shí)別和感染宿主ACE2蛋白的關(guān)鍵蛋白。
圖2 基于共價(jià)適配體的策略，通過特異性
近距離交聯(lián)來(lái)檢測(cè)和阻斷靶蛋白
03
研究結(jié)果
NO-1
候選共價(jià)適體的合成和表征
首先，作者選擇了3種親電能力各異的共價(jià)標(biāo)簽，合成了三種備選的共價(jià)核酸適體。然后通過凝膠電泳實(shí)驗(yàn)綜合分析了交聯(lián)反應(yīng)效率、特異性和速率，發(fā)現(xiàn)中等親電能力的NHS標(biāo)記的共價(jià)核酸適體表現(xiàn)最佳，將其選為后續(xù)應(yīng)用的探針。(圖3)
圖3 三種候選共價(jià)適配體的合成和表征
NO.2
N蛋白共價(jià)適體的性能表征
然后作者測(cè)試了共價(jià)核酸適體、傳統(tǒng)核酸適體以及抗體與NP的親和力。結(jié)果表明：與傳統(tǒng)核酸適體相比，共價(jià)核酸適體的解離速率常數(shù)Koff降低了2個(gè)數(shù)量級(jí)左右，親和力(Kd)提高了30-60倍左右，與抗體相當(dāng)甚至優(yōu)于抗體。共價(jià)適體-NP復(fù)合能耐受多次洗滌、EDTA和尿素等環(huán)境因素的干擾，且對(duì)靶蛋白的結(jié)合具有優(yōu)異的選擇性。(圖4)
圖4 共價(jià)適配體策略具有更強(qiáng)的抗環(huán)境
干擾能力和更高的特異性結(jié)合能力
NO.3
基于共價(jià)適體的N蛋白ELISA檢測(cè)
接下來(lái)，作者比較了共價(jià)核酸適體ELISA、核酸適體ELISA和抗體ELISA檢測(cè)NP的性能。在嚴(yán)格洗滌條件下，共價(jià)核酸適體ELISA的檢測(cè)限(8.70pg/mL)和線性范圍(81–2187pg/mL)均優(yōu)于抗體ELISA的檢測(cè)限(70.0pg/mL)和線性范圍(81–19683pg/mL)。另外，在嚴(yán)格的洗滌條件下，共價(jià)核酸適體ELISA具有更好的檢測(cè)特異性。(圖5)
圖5 在不同的洗滌緩沖液下使用各種探針檢測(cè)NP
NO.4
RBD蛋白共價(jià)適體的性能表征
接著，作者研究了RBD共價(jià)適體的結(jié)合和交聯(lián)性能。研究發(fā)現(xiàn)RBD適體偶聯(lián)上NHS標(biāo)簽后，親和力提高了25倍，結(jié)合速率顯著提升且從靶標(biāo)處的脫落速率顯著下降，此外共價(jià)核酸適體在生理Mg2+濃度下也能高效結(jié)合RBD蛋白。這十分有利于共價(jià)適體對(duì)新-冠病毒蛋白的中和和新-冠病毒的侵染阻斷。(圖6)
圖6 共價(jià)交聯(lián)提高適配體的結(jié)合性能并減少靶標(biāo)結(jié)合處的脫落
NO.5
共價(jià)RBD核酸適配體的結(jié)合能力
最后，作者研究了共價(jià)核酸適體、抗體和核酸適體阻斷RBD與ACE2結(jié)合的能力。結(jié)果表明共價(jià)核酸適體阻斷RBD-ACE2結(jié)合的能力(IC50=0.42nM)顯著優(yōu)于與抗體(IC50=1.19nM)和核酸適體(IC50=21.5nM)，結(jié)合速率更快且脫落速率更慢。因此，在模擬血管和剪切應(yīng)力的循環(huán)流動(dòng)裝置中，共價(jià)核酸適體比抗體和核酸適體具有更強(qiáng)的能力阻斷RBD和ACE2的結(jié)合。在新冠假病毒中和實(shí)驗(yàn)中，共價(jià)核酸適體的半數(shù)中和濃度僅需約2nM, 最高中和效率達(dá)到95%，對(duì)比之下，抗體的半數(shù)中和濃度約6nM, 最高中和效率83%。(圖7)
圖7 共價(jià)交聯(lián)策略提高了RApt惡劣環(huán)境下介導(dǎo)的阻斷能力
04
結(jié)論和展望
2022年的Nobel化學(xué)獎(jiǎng)?lì)C給了點(diǎn)擊化學(xué)和生物正交化學(xué)，本研究正是利用活性很高的“Click"基團(tuán)，并基于鄰近驅(qū)動(dòng)的共價(jià)偶聯(lián)策略實(shí)現(xiàn)了對(duì)新-冠病毒的靈敏檢測(cè)和高效中和。共價(jià)策略通過將適體與靶蛋白之間的非共價(jià)結(jié)合模式轉(zhuǎn)化為共價(jià)結(jié)合模式，增強(qiáng)了識(shí)別能力并降低了解離速率，能進(jìn)一步推動(dòng)適體在診斷、分子成像、疾病治療和其他生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。這項(xiàng)研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、浙江省自然科學(xué)基金、中國(guó)博士后科學(xué)基金和德國(guó)亞歷山大·洪堡研究基金的資助和支持。
本研究所用普諾賽產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) |
L-谷氨酰胺溶液(200mM)，100× | PB180420 |
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