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bEnd.3 [BEND3] (小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞)是從來自患有內(nèi)皮瘤的小鼠腦組織中分離的內(nèi)皮細胞，該細胞通過表達多瘤病毒中間T抗原的NTKmT逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染而轉(zhuǎn)化。在培養(yǎng)時，bEnd.3細胞最常遇到的問題就是細胞形態(tài)變化和難消化，本期細胞學堂將幫您逐一解決。
細胞形態(tài)問題
bEnd.3細胞本身生長較慢，在低密度時會呈現(xiàn)不規(guī)則細胞形態(tài)，高密度時則呈規(guī)則纖維狀，所以若在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)異常，則有可能是細胞密度低，建議細胞鋪滿密度較高時傳代。以下為bEnd.3細胞不同密度培養(yǎng)圖片：
低密度（100倍鏡）
中密度（100倍鏡）
高密度（100倍鏡）
消化問題
bEnd.3細胞培養(yǎng)時間越長越難消化，培養(yǎng)4天傳代，一般消化3-5分鐘；培養(yǎng)7天傳代，一般消化5-10分鐘。具體消化時間以顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)為準。
培養(yǎng)7天，消化5分鐘顯微圖
培養(yǎng)7天，消化10分鐘顯微圖
如遇到消化困難不必擔心，可通過分次消化的方式解決，具體操作方法如下（以T25瓶細胞為例）：
吸出原培養(yǎng)液；
加入2mL左右PBS，輕輕晃動培養(yǎng)瓶潤洗細胞，吸出PBS丟棄；
加入1mL左右胰酶，輕輕晃動培養(yǎng)瓶使之浸潤所有細胞；
放入培養(yǎng)箱消化，消化3-5分鐘（根據(jù)具體細胞稍作延長或縮短），顯微鏡下看到細胞開始漂浮，可以加入2mLPBS，晃動培養(yǎng)瓶使細胞懸浮，不要吹打剩下的貼壁細胞；
吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)的PBS和細胞懸液，轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，在離心管中加入3mL含血清的培養(yǎng)基終止消化并吹散細胞，使細胞盡量呈單顆細胞的懸浮液；
原培養(yǎng)瓶中加入0.5mL胰酶，晃動培養(yǎng)瓶浸潤細胞，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)消化，直到細胞塊中間全部收縮變圓，晃動培養(yǎng)瓶可脫落；
用3mL含血清的培養(yǎng)基終止消化，將瓶底的細胞全部吹下，并輕輕吹吸分散細胞呈單顆；
收集細胞懸液與第一次消化下來的細胞合并到一個離心管；
離心收集細胞沉淀，1200rpm/min 3分鐘，離心完吸出上清丟棄；
加入新鮮培養(yǎng)基，吹打幾下混勻細胞，按需接種到新培養(yǎng)瓶，補足培養(yǎng)基，擰松瓶蓋或使用透氣瓶蓋進行培養(yǎng)；
檢查培養(yǎng)箱二氧化碳，溫度和水盤。
培養(yǎng)小貼士
01
細胞培養(yǎng)過程中形態(tài)多樣，低密度時容易出現(xiàn)放射狀細胞，看似已經(jīng)鋪滿瓶底，其實細胞量較少，需要細胞胞體排列緊密的時候進行傳代；
02
細胞培養(yǎng)過程中避免頻繁換液，可以每隔2-3天換液或者半量換液一次；
03
培養(yǎng)過程中會產(chǎn)生10%左右活的單顆漂浮細胞，貼壁細胞密度偏低時，注意收集懸浮細胞，貼壁細胞密度偏高時，可以換液時丟棄；
04
接種量對細胞生長有影響，接種量過低細胞會有增殖緩慢，漂浮過多的現(xiàn)象，請注意控制傳代比例；
05
細胞對溫度和pH較敏感，傳代或換液前培養(yǎng)基可以常溫復溫4小時以上；避免使用pH改變（偏酸：顏色偏黃；偏堿：顏色偏紫紅）的培養(yǎng)基；
06
細胞傳代過程中若出現(xiàn)單次消化時間過長，可進行分次消化，切不可將細胞強行吹下來，以避免吹打造成細胞機械損傷。
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